传说，秘鲁的密林中，有一座神秘之城。神秘之城由纯金建造、活死人守护，地址不详。然而，不知何年何月，竟有人从这座神秘的黄金城里盗出了供奉的水晶头骨！传说有云：不论是谁将头骨完璧归赵，带回黄金城古庙，便将得到无上的权力......
1957年，阴云密布的冷战高峰时期。自印第安纳·琼斯（哈里森·福特）上一次找寻圣杯死里逃生之后，转眼已过了19年。依然精力充沛的琼斯，也在马歇尔大学过着平静的教书生活，早已不复当年纵横四海天涯历险的刺激。
然而一次偶然，琼斯得知了传说中水晶头骨的秘密。这个极有可能成为史上最杰出考古发现的机会，不由得让他血脉贲张。于是，在叛逆的年轻助手马特·威廉姆斯（希亚·拉比沃夫）的陪伴下，一老一小辗转新墨西哥、康涅狄格、墨西哥城和秘鲁丛林展开新的冒险之旅。但很快，琼斯就发觉寻找水晶头骨的“伴儿”还不止一个！贪婪的苏联间谍们也在各处搜寻，希冀解开水晶头骨的秘密，让苏联称霸世界！
为首的冷酷美女间谍伊莉娜（凯特·布兰切特），不仅带着精锐部队，还不惜绑架琼斯的旧爱玛丽昂·瑞文伍德（凯伦·艾伦），想以此要挟他帮助寻找头骨的下落。神秘的水晶头骨之中，到底隐藏着怎样惊天的秘密？面对亡命徒、野心家和苏联的围追堵截，琼斯和马特又能不能抢定先机？这趟夺宝的路上必定充满了惊心动魄的冒险……